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フロンティア科学総合研究センター 生命科学研究支援部門RI分野清武分室 |
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准教授 |
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関連SDGs |
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論文 【 表示 ／ 非表示 】
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Germany E.M., Thewasano N., Imai K., Maruno Y., Bamert R.S., Stubenrauch C.J., Dunstan R.A., Ding Y., Nakajima Y., Lai X.F., Webb C.T., Hidaka K., Tan K.S., Shen H., Lithgow T., Shiota T.
eLife 12 2024年1月
記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌） 出版者・発行元：eLife
Outer membrane proteins (OMPs) are essential components of the outer membrane of Gram-negative bacteria. In terms of protein targeting and assembly, the current dogma holds that a 'β-signal' imprinted in the final β-strand of the OMP engages the β-barrel assembly machinery (BAM) complex to initiate membrane insertion and assembly of the OMP into the outer membrane. Here, we revealed an additional rule that signals equivalent to the β-signal are repeated in other, internal β-strands within bacterial OMPs, by peptidomimetic and mutational analysis. The internal signal is needed to promote the efficiency of the assembly reaction of these OMPs. BamD, an essential subunit of the BAM complex, recognizes the internal signal and the β-signal, arranging several β-strands and partial folding for rapid OMP assembly. The internal signal-BamD ordering system is not essential for bacterial viability but is necessary to retain the integrity of the outer membrane against antibiotics and other environmental insults.
DOI： 10.7554/eLife.90274
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Germany E., Shiota T.
Methods in Enzymology 707 237 - 256 2024年1月
記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌） 出版者・発行元：Methods in Enzymology
The BPA photo-crosslinking method exploits the property of p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa), an amino acid containing a photoreactive side chain, and allows for the crosslinking with nearby proteins upon Ultraviolet irradiation. This feature enables the capture of two proteins within a close proximity with high spatial resolution at the level of amino acid residues. In this chapter, we introduce an example of the employment of the BPA photo-crosslinking method to the Translocase of the Outer Mitochondrial membrane complex of mitochondria in Saccharomyces cerevisiae as a model protein translocase. Here in, we provide three procedures (i) the introduction of pBpa into proteins of interest in living yeast cells by in vivo suppressor tRNA system; (ii) analysis of in vivo subunit-subunit interactions intra-complex; and (iii) analysis of translocase channel-substrate interactions in organello. The use of in vivo and in organello crosslinking tools enable the robust analysis of translocases in a near-to physiological condition.
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Aoki E., Germany E., Shiota T.
Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 2778 65 - 81 2024年
記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌） 出版者・発行元：Methods in molecular biology (Clifton, N.J.)
The in vitro reconstruction assay enables us to evaluate in detail the insertion and proper protein folding (together termed assembly) of β-barrel membrane proteins. Here, we introduce an in vitro reconstitution experiments using isolated membrane fractions from Escherichia coli (E. coli). Membrane fractions isolated from E. coli cells and disrupted by sonication, which we have termed E. coli microsomal (mid-density) membrane (EMM), are ideal for biochemical experiments, as they can be harvested by high-speed centrifugation and do not require ultra-centrifugation. EMM pretreated with detergent can assemble externally supplemented β-barrel membrane proteins via intact β-barrel assembly machinery (BAM) complex retained in EMM. This method not only allows assembly analysis with inexpensive equipment but it also can be applied to drug screening using assembly as an indicator with high reproducibility. In this chapter, we introduce our method of evaluating assembled β-barrel membrane proteins by demonstrating four representative β-barrel membrane proteins: E. coli major porins OmpA and OmpF; enterohemorrhagic E. coli (EHEC) autotransporter EspP, and Haemophilus influenzae (H. influenzae) adhesin Hia.
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Thewasano N., Germany E.M., Maruno Y., Nakajima Y., Shiota T.
Journal of Biological Chemistry 299 ( 7 ) 104821 - 104821 2023年7月
記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌） 出版者・発行元：Journal of Biological Chemistry
The outer membrane (OM) of gram-negative bacteria is populated by various outer membrane proteins (OMPs) that fold into a unique β-barrel transmembrane domain. Most OMPs are assembled into the OM by the β-barrel assembly machinery (BAM) complex. In Escherichia coli, the BAM complex is composed of two essential proteins (BamA and BamD) and three nonessential accessory proteins (BamB, BamC, and BamE). The currently proposed molecular mechanisms of the BAM complex involve only essential subunits, with the function of the accessory proteins remaining largely unknown. Here, we compared the accessory protein requirements for the assembly of seven different OMPs, 8- to 22-stranded, by our in vitro reconstitution assay using an E. coli mid-density membrane. BamE was responsible for the full efficiency of the assembly of all tested OMPs, as it enhanced the stability of essential subunit binding. BamB increased the assembly efficiency of more than 16-stranded OMPs, whereas BamC was not required for the assembly of any tested OMPs. Our categorization of the requirements of BAM complex accessory proteins in the assembly of substrate OMPs enables us to identify potential targets for the development of new antibiotics.
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Koyamatsu D, Otsubo M, Ohira T, Sato MP, Suzuki-Masuko H, Shiota T, Takano KT, Ozeki M, Otsuka K, Ogura Y, Hayashi T, Watanabe M, Inaba T, Ito-Inaba Y
Physiologia plantarum 175 ( 4 ) e13957 2023年6月
記述言語：英語 掲載種別：研究論文（学術雑誌） 出版者・発行元：Physiologia Plantarum
In floral thermogenesis, sugars play an important role not only as energy providers but also as growth and development facilitators. Yet, the mechanisms underlying sugar translocation and transport in thermogenic plants remain to be studied. Asian skunk cabbage (Symplocarpus renifolius) is a species that can produce durable and intense heat in its reproductive organ, the spadix. Significant morphological and developmental changes in the stamen are well-characterized in this plant. In this study, we focused on the sugar transporters (STPs), SrSTP1 and SrSTP14, whose genes were identified by RNA-seq as the upregulated STPs during thermogenesis. Real-time PCR confirmed that mRNA expression of both STP genes was increased from the pre-thermogenic to the thermogenic stage in the spadix, where it is predominantly expressed in the stamen. SrSTP1 and SrSTP14 complemented the growth defects of a hexose transporter-deficient yeast strain, EBY4000, on media containing 0.02, 0.2, and 2% (w/v) glucose and galactose. Using a recently developed transient expression system in skunk cabbage leaf protoplasts, we revealed that SrSTP1 and SrSTP14-GFP fusion proteins were mainly localized to the plasma membrane. To dig further into the functional analysis of SrSTPs, tissue-specific localization of SrSTPs was investigated by in situ hybridization. Using probes for SrSTP14, mRNA expression was observed in the microspores within the developing anther at the thermogenic female stage. These results indicate that SrSTP1 and SrSTP14 transport hexoses (e.g., glucose and galactose) at the plasma membrane and suggest that SrSTP14 may play a role in pollen development through the uptake of hexoses into pollen precursor cells.
DOI： 10.1111/ppl.13957
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ミトコンドリアポリンタンパク質Por1による外膜透過装置TOM複合体のアセンブリー制御
阪上 春花, 塩田 拓也, 石坂 直也, 田村 康, 遠藤 斗志也
日本生化学会大会プログラム・講演要旨集 91回 [2T13a - 07(2P 2018年9月
記述言語：日本語 掲載種別：記事・総説・解説・論説等（大学・研究所紀要） 出版者・発行元：(公社)日本生化学会
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ミトコンドリアポリンタンパク質Por1は外膜透過装置TOM複合体のアセンブリー調節因子として機能する
阪上 春花, 石坂 直也, 塩田 拓也, 田村 康, 遠藤 斗志也
生命科学系学会合同年次大会 2017年度 [2P - 0271] 2017年12月
記述言語：日本語 掲載種別：記事・総説・解説・論説等（大学・研究所紀要） 出版者・発行元：生命科学系学会合同年次大会運営事務局
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[Molecular architecture and function of mitochondrial protein entry gate].
Shiota T
Seikagaku. The Journal of Japanese Biochemical Society 89 ( 2 ) 282 - 285 2017年4月
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Tom22のミトコンドリア局在化におけるPor1の役割の解明
石坂 直也, 塩田 拓也, 田村 康, 遠藤 斗志也
日本生化学会大会・日本分子生物学会年会合同大会講演要旨集 88回・38回 [2P0021] - [2P0021] 2015年12月
記述言語：日本語 掲載種別：記事・総説・解説・論説等（大学・研究所紀要） 出版者・発行元：(公社)日本生化学会
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Mitochondrial biogenesis: Cell-cycle-dependent investment in making mitochondria
Shiota T., Traven A., Lithgow T.
Current Biology 25 ( 2 ) R78 - R80 2015年1月
記述言語：日本語 掲載種別：記事・総説・解説・論説等（大学・研究所紀要） 出版者・発行元：Current Biology
© 2015 Elsevier Ltd. All rights reserved. Mitochondria cannot be made de novo, so pre-existing mitochondria must be inherited at each cell division. A new study demonstrates cell-cycle-dependent regulation of the activity of the TOM translocase complex to induce mitochondrial biogenesis during the M phase of the cell cycle.
科研費（文科省・学振・厚労省）獲得実績 【 表示 ／ 非表示 】
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NR, QCM-D, AFMを駆使したタンパク質輸送装置の「超」複合体の解析
研究課題/領域番号：24KK0138 2024年04月 - 2027年03月
独立行政法人日本学術振興会 科学研究費基金 国際共同研究加速基金（海外連携研究）
担当区分：研究代表者
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中性子反射率法による生体膜解析法の開発
研究課題/領域番号：22K12672 2022年04月 - 2025年03月
独立行政法人日本学術振興会 科学研究費基金 基盤研究(C)
塩田 拓也
担当区分：研究代表者
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中性子反射率法を中心とした多角的な解析によるグラム陰性菌の膜生合成解析
研究課題/領域番号：21KK0126 2021年04月 - 2024年03月
独立行政法人日本学術振興会 科学研究費補助金 国際共同研究加速基金(国際共同研究強化(B))
塩田 拓也, 田岡 東, 宮崎 亮次, 竹田 弘法
担当区分：研究代表者
本研究では、生体高分子の高い時空間分解能での解析を実現する手法として、中性子反射率法を中心に、in vivoでの架橋法、クライオ電子顕微鏡による構造解析、高速AFM、そして単離膜を用いたin vitro再構築実験の5つの多角的な手法を駆使し、これらを組み合わせた統合的な解析法の確立を目指している。そのモデルケースとして、大腸菌のBAM複合体を中心とした外膜タンパク質輸送複合体および、磁性細菌のマグネトソーム形成タンパク質を用いる。初年度は、国際共同研究先の渡航制限が解除されず、オンラインでの共同研究にとどまったが、BAM複合体の中性子反射率実験で得られたデータ解析を共同で実施し、基質が結合した状態のBAM複合体の分子形態を決定することができた。また、in vitro再構築実験系では、輸送されるタンパク質が持っている新規シグナルを決定し、過渡的な中間体を形成する新規条件を確立した。また、架橋実験では、多様な因子による補助を必要とするLptDのアセンブリーに着目し、それぞれの因子がどのように相互作用しているかを高い空間分解能で決定した。さらにクライオ電子顕微鏡による構造解析では、輸送装置の精製に成功し、現在再構築実験で見出された中間体の構造解析を実現すべく変異基質の精製を進めている。また、高速AFMでは、マグネトソームの形成再現に必要な因子を同定するとともに、マグネトソーム小胞の精製法を検討した。さらに、細菌表層の高速AFMによるイメージングのための固定化技術の確立および、動的な物性変化を捉えることに成功している。
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EMMアセンブリーアッセイによる大腸菌βバレル型膜タンパク質の膜挿入機構の解析
研究課題/領域番号：18H06052 2018年 - 2020年03月
日本学術振興会 科学研究費補助金 研究活動スタート支援
塩田 拓也
大腸菌等のグラム陰性菌外膜にはβバレル型膜タンパク質が存在し、これらは生育、感染および、毒物の排出等、重要な役割を担う。βバレル型膜タンパク質の外膜への正しい立体構造を伴った組込みは、BAM複合体と呼ばれるタンパク質複合体によって行われる。BAM複合体はBamA, B, C, D, Eの5つのタンパク質から構成されており、近年その立体構造が解かれたが、各サブユニットの役割等は不明なままである。本研究では、研究者が独自に開発したin vitro再構築実験系、EMMアセンブリーアッセイを用いて、各サブユニットの役割の決定を通して、BAM複合体の分子機構の解明を目指す。
これまでに、EMMアセンブリーアッセイによる解析から、BamCはBAM複合体から基質タンパク質を送り出す役割を担っていることを明らかにした。報告されているBAM複合体の立体構造では、BamCはその一部が観察されているのみで、大部分の構造は観察されていなかった。そこで、in vivo部位特異的光架橋法により生細胞内でのBamC分子全体の相互作用マップを作製し、BamCのC末端ドメインがBamAの細胞表層に露出している部分と相互作用していることを明らかにした。この配置は、ミトコンドリアに存在するBAM複合体のホモログSAM複合体に存在するSam37と同様であった。Sam37は、BamCと同様に基質の送り出しに関わるため、両者は同様の分子機構を有していると考えられる。その他、EMMアセンブリーアッセイを用いて、BAM複合体の機能を阻害するペプチド断片を数種決定した。現在、その他のサブユニットの機能解析を進めると共に、阻害ペプチドの作用機構を解析し、機能に重要な領域を決定することを試みている。